Attualmente, presso l’ARPA Valle d’Aosta, vengono effettuate le seguenti analisi:

  1. di screening;
  2. qualitative (presenza/assenza) per mais Bt11, Bt 176, MON810, GA21 e NK603, soia RR (Roundup Ready);
  3. quantitative per soia RR (Roundup Ready) e mais Bt 176 e MON810.

 

  1. Le analisi di screening rilevano la presenza di sequenze di regolazione genica: il promotore 35S, in particolare, è inserito nel genoma della quasi totalità delle piante geneticamente modificate e si ritrova, quindi, anche negli alimenti da esse derivati. Sfruttando la tecnica PCR è possibile amplificare e rilevare le sequenze transgeniche. La rilevazione avviene tramite elettroforesi su gel di agarosio addizionato con bromuro di etidio come colorante ( il DNA così colorato è reso fosforescente all’UV). La positività a tale test consente di affermare che è avvenuta una modificazione genetica.
  2. Le determinazioni qualitative sono volte a determinare la presenza/assenza delle sequenze geniche specifiche dei differenti OGM su mais (Bt11, Bt 176, MON810, GA21 e NK603) e soia RR (Roundup Ready ) e possono essere effettuate o tramite PCR/corsa elettroforetica su gel o tramite l’utilizzo della PCR/Real Time.
  3. Le determinazioni quantitative sono, invece, volte a quantificare, mediante la tecnica PCR-Real Time, la percentuale di materiale OGM presente nel prodotto.

 

Di seguito sono dettagliate le principali fasi analitiche.

a. estrazione del DNA (per analisi quali-quantitative)
La prima cosa da fare è isolare ed estrarre il Dna dalla matrice da analizzare. Per manipolare, infatti, gli acidi nucleici, bisogna prima di tutto separarli dalle altre componenti cellulari (proteine, lipidi, carboidrati). Ogni isolamento di Dna comincia con una rottura chimica ed enzimatica delle pareti cellulari, attraverso la dissoluzione della membrana cellulare e nucleare tramite dei detergenti ed enzimi che non danneggiano il Dna. Al termine di una serie di passaggi si arriva a recuperare il Dna genomico in una microprovetta. Successivamente si procede a quantificare la concentrazione del DNA estratto mediante spettrofotometro UV: esiste, infatti, un rapporto lineare fra l'assorbimento e la concentrazione della macromolecola di DNA.

b. amplificazione (vedi PCR)
Si tratta di un processo ciclico, in cui ogni ciclo prevede tre fasi successive e permette, al termine di n° cicli, di avere milioni di molecole di uno specifico tratto di DNA.

c. determinazione della percentuale di DNA transgenico
Lo strumento per PCR-Real Time utilizzato presso il laboratorio dell'ARPA è l’I-Cycler.
Esso si basa sul seguente principio di funzionamento: i campioni vengono irradiati da una sorgente ad una certa lunghezza d'onda e la fluorescenza emessa viene rilevata strumentalmente, il tutto sotto il controllo di un computer. La chimica di reazione della PCR Real time legata alla fluorescenza prevede l'uso di sonde legate a molecole fluorescenti che hanno una molecola "Reporter" e una molecola "Quencher". Quest’ultima impedisce al Reporter di emettere liberamente il segnale. Quando la polimerasi sintetizza il filamento complementare al DNA stacca la sonda da quest'ultimo e la taglia: in questo modo il reporter passa in soluzione aumentando l’intensità della fluorescenza che sarà direttamente proporzionale alla concentrazione di amplificato specifico. Se nella reazione erano presenti campioni a quantità nota di Dna dai quali viene ricavata una retta di riferimento, è possibile calcolare la quantità di Dna iniziale presente in campioni oggetto di studio. Basando il metodo di calcolo sul rapporto fra Dna transgenico e quantità di Dna totale, si è in grado di definire la percentuale di OGM all’interno del campione da testare.

I-cycler1 001 s
I-Cycler con Termociclatore 
I-cycler1 004 s
Tecnico che opera alla cappa a flusso laminare 
I-cycler1 006 s
I-Cycler 
Etoiles inactivesEtoiles inactivesEtoiles inactivesEtoiles inactivesEtoiles inactives
 
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